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Nature Microbiology (2023)Citar este artículo

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Los plásmidos conjugativos son elementos genéticos móviles autotransmisibles que transfieren ADN entre células huésped a través de sistemas de secreción de tipo IV (T4SS). Si bien la conjugación mediada por T4SS ha sido bien estudiada en bacterias, la información es escasa en Archaea y solo existen representantes conocidos en el orden Sulfolobales de Crenarchaeota. Aquí presentamos el primer plásmido autotransmisible identificado en un Euryarchaeon, Thermococcus sp. 33-3. El plásmido de 103 kpb, pT33-3, se ve en los espaciadores CRISPR en todo el orden Thermococcales. Demostramos que pT33-3 es un plásmido conjugativo de buena fe que requiere contacto de célula a célula y depende de genes similares a T4SS canónicos codificados por plásmidos. En condiciones de laboratorio, pT33-3 se transfiere a varios Thermococcales y los transconjugantes se propagan a 100 °C. Usando pT33-3, desarrollamos un conjunto de herramientas genéticas que permite la modificación de genomas Archaeal filogenéticamente diversos. Demostramos la movilización de plásmidos mediada por pT33-3 y la posterior modificación del genoma dirigida en especies de Thermococcales previamente no transformables, y extendemos este proceso a la transferencia de interphylum a un Crenarchaeon.

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La secuencia del genoma de Thermococcus sp. 33-3 ha sido depositado en la ENA (número GCA_946300405). Las secuencias de todos los plásmidos, genomas y cebadores utilizados en este estudio están disponibles en Dryad en https://doi.org/10.5061/dryad.2jm63xst9.

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Agradecemos a N. Soler por su asesoramiento al escribir este manuscrito. Este proyecto recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 772725, proyecto HiPhore to PF), en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 340440, proyecto EVOMOBIL a PF) y por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM118160 a MT).

Unidad de Biología Molecular del Gen en Extremófilos (BMGE), Departamento de Microbiología, Institut Pasteur, París, Francia

Ryan J. Catchpole, Patrick Forterre y Violette Da Cunha

Instituto de Biología Integrativa de la Célula (I2BC), CEA, CNRS, Univ. París-Sud, Univ. París-Saclay, Gif-sur-Yvette, Cedex, Francia

Ryan J. Catchpole, Evelyne Marguet, Jacques Oberto, Patrick Forterre y Violette Da Cunha

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Ryan J. Catchpole y Michael Tern

Genómica Metabólica, Genoscopio, Instituto François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Universidad Paris-Saclay, Evry, Francia

Valérie Barbe, Ghislaine Magdelenat y Violette Da Cunha

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RJC y EM realizaron los experimentos, VB y GM realizaron la secuenciación, RJC, JO y VDC realizaron análisis bioinformáticos. MT, PF, JO y VDC supervisaron aspectos del proyecto y proporcionaron un análisis experto esencial. RJC escribió el manuscrito, con aportes de MT, PF, JO y VDC

Correspondencia a Ryan J. Catchpole o Violette Da Cunha.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Adam Valcek y Christa Schleper por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Alineación del genoma entre Thermococcus. sp. 33-3 y cepas o especies estrechamente relacionadas, T. nautili (a); T. henrietii EXT12c (b); y T sp. 26-2 (c). Los puntos (que forman líneas) indican la identidad de secuencia entre las regiones correspondientes del cromosoma para las dos especies indicadas. Las discontinuidades indican indeles; los cambios de dirección, por ejemplo, cambiar de apuntar de noreste a sureste, indican inversiones a gran escala.

Gráfico de sesgo de GC acumulativo [(GC)/(G + C)] y exceso de ceto [(G + T)-(C + A)] para pT33-3. Los puntos de inflexión agudos son a menudo indicativos de los orígenes de la replicación, los orígenes de la transferencia o los sitios de terminación de la replicación. Estos sitios están indicados por líneas discontinuas verticales.

Los diamantes indican datos de una sola réplica biológica (para WT con plásmido objetivo, los puntos superpuestos oscurecen los datos, n = 3). El T. kodakarensis de tipo salvaje (TS559) no puede ser transformado por plásmidos que codifican una secuencia complementaria a los espaciadores en su matriz CRISPR (plásmido objetivo). Por el contrario, los plásmidos no objetivo se transforman a ~100 ufc/μg de ADN. La eliminación de genes que codifican todas las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) suprime esta actividad dirigida, restaurando la transformación con plásmidos codificantes de objetivos.

PCR de knockouts para genes de transferencia previstos, p0019 y p0132. La PCR se llevó a cabo usando cebadores que se unían a pT33-3 fuera de los brazos de homología usados en la recombinación pop-in/pop-out.

a) T. kodakarensis incubada con ADN de plásmido purificado (presentado como transformantes por ADN fg para una escala comparable) - T. kodakarensis es naturalmente competente para la captación de ADN. b) Transferencia de un plásmido no conjugado de un donante de T. kodakarensis a un receptor sin plásmido: la transferencia de plásmidos entre cepas de T. kodakarensis se produce mediante un simple cocultivo. c) Transferencia de un marcador cromosómico prototrófico de un donante de T. kodakarensis a un receptor auxotrófico - transferencia de marcadores cromosómicos entre cepas de T. kodakarensis. d) Transferencia de un marcador cromosómico prototrófico de un donante de T. gammatolerans a un receptor auxotrófico de T. kodakarensis: los marcadores cromosómicos no pueden transferirse entre T. gammatolerans y T. kodakarensis, lo que sugiere que el intercambio alélicos está mediado por recombinación homóloga. e) Transferencia de un marcador prototrófico cromosómico de un donante de T. kodakarensis a un receptor auxotrófico donde el marcador está codificado en un locus que codifica un segundo marcador prototrófico: la transferencia de marcadores cromosómicos requiere un sitio genómico receptivo adecuado (no esencial). Las réplicas biológicas individuales (-, n = 3) se presentan con el promedio y la desviación estándar indicados por barras de error. gi) A diferencia de T. kodakarensis, T. nautili no puede recibir un vector lanzadera mediante cultivo conjunto, mientras que pT33-3 se transfiere fácilmente (ver texto principal y Fig. 2c).

Se clonaron regiones de 1,5 kb que rodeaban a los mínimos/máximos de GC-skew/ceto exceso en un vector lanzadera y se observó la transferencia en presencia de pT33-3 de donantes de T. kodakarensis. a) región candidata oriT1. Si bien los plásmidos que codifican esta región se transfirieron fácilmente entre cepas de T. kodakarensis, se observó una transferencia mínima a los receptores de T. nautili y T. gammatolerans. b) región candidata oriT2. Los plásmidos que codifican esta región se transfirieron fácilmente de T. kodakarensis a T. kodakarensis, T. nautili y T. gammatolerans, lo que indica que esta región codifica el oriT de pT33.3. c) la región oriT2 se dividió en cuatro fragmentos superpuestos. Los plásmidos que codifican las regiones oriT2.1 y oriT2.2 se transfirieron a los receptores no competentes, mientras que oriT2.3 y oriT2.4 no lo hicieron, lo que indica que oriT está codificado por la región superpuesta entre oriT2.1 y oriT2.2. d) La superposición de 300 pb entre oriT2.1 y oriT2.2 (denominado oriT300) también confiere capacidad de movilización a los plásmidos, lo que indica que esta región codifica la oriT de pT33.3.

a) Figura adaptada de la Figura 6 de Guglielmini et al.33 (10.1093/nar/gku194) donde se proponía que todas las secuencias arqueológicas de VirB4 surgen de una transferencia de bacterias dentro del grupo MPFFATA. b) Recreación de la filogenia de MPFFATA y MPFFA que incluye secuencias de VirB4 de elementos integrados en otros genomas de arqueas y el homólogo de VirB4 de pT33-3. Filogenia enraizada con el grupo externo MPFF. Los grupos pT33-3 VirB4 dentro de un clado de secuencias Crenarchaeal, lo que sugiere que pT33-3 surgió de una transferencia entre filos. Las ramas admitidas, calculadas por aLRT >80 o UFBoot >95, se indican mediante puntos en los nodos (el árbol completo se proporciona como un archivo de datos ampliado). La barra de escala indica el número promedio de sustituciones por sitio.

a) Diagrama esquemático del plásmido movilizable (pMob) que codifica las secuencias oriT de pT33-3 y la recombinación homóloga + casete marcador seleccionable para el intercambio alelo. b) La transferencia de pMob que se inicia en oriT1 y termina en oriT2 da como resultado la transferencia de un casete de recombinación/marcador que codifica ADN no replicativo. Este puede ser un sustrato para la recombinación homóloga y el intercambio alélico con el cromosoma receptor. c) La transferencia de pMob que se inicia en oriT2 y termina en oriT1 da como resultado la transferencia de un ADN replicativo sin ningún marcador seleccionable. La selección de transformantes en medios que contienen fármacos hace que estas células no sean viables.

Se seleccionaron ocho colonias usando cebadores que se unían al cromosoma de S. marinus, fuera de los brazos de homología usados en el intercambio alélicos. Se observó intercambio alélico limpio (Δapt::SimR) en 2/8 colonias. Se muestran los datos de una réplica representativa, pero se obtuvieron datos similares en 3 ocasiones.

Predicción bioinformática de la función ORF de pT33-3. Se usó una combinación de BLAST y HHblits para predecir funciones para cada ORF en pT33-3. BLAST se realizó contra la base de datos de proteínas no redundantes. Los aciertos con valor E < 0,01 se resaltan en amarillo. HHblits se realizó contra la base de datos UniProt; sin embargo, la mayoría de los resultados arrojaron "proteína hipotética" o "proteína no caracterizada". Por lo tanto, los resultados se limitaron aún más a aquellos con anotaciones funcionales.

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Catchpole, RJ, Barbe, V., Magdlenat, G. et al. Un plásmido autotransmisible de un hipertermófilo que facilita la modificación genética de diversas Archaea. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01387-x

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Recibido: 08 Agosto 2022

Aceptado: 19 de abril de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01387-x

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